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细菌纤维素支架的复合改性与生物性能

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摘要:采用原花青素交联和仿生矿化技术,以生物相容性良好的细菌纤维素(BC)为原材料制备了BC/多肽(pol)和BC/多肽/羟基磷灰石(HAp)复合材料,并利用场发射扫描电镜、X射线衍射仪和红外光谱仪对制备材料进行分析表征,采用成骨细胞评估了几种支架材料的生物相容性。结果表明,交联和仿生矿化成功地将pol和HAp引入到BC的表面和内部,细胞实验表明,3种支架材料均具有一定的生物相容性,且复合改性提高了支架材料的生物活性,制备的材料具有优异的性能,是具有应用前景的组织工程支架材料。

关键词:细菌纤维素;多肽;复合;羟基磷灰石;生物相容性

近年来,随着人们对组织工程发展的需要,用于组织工程支架的材料越来越多,并取得了显著成效。细菌纤维素(BC)作为一种天然的纳米纤维材料因其独特的性能被认为是构建新一代仿生纳米组织工程支架的理想材料。其主要特点为:制备简单,力学性能优异,结构与体内细胞外基质(ECM)存在相似性易于塑形,自身呈三维网状结构,结晶度和纯度高,不含有植物纤维素中的木质素和半纤维素,良好的生物相容性,生物合成可调控,复合改性方法多样化等。因此,BC成为近几年生物材料领域新的研究热点,在许多组织工程领域具有极好的前景。BC纳米纤维虽然具有与天然纳米胶原纤维相似的形貌,但是作为天然多糖类,是一种惰性材料。为使BC纳米纤维更好地模拟天然ECM,需要在纤维表面固定生物活性物质。许多研究学者,对BC表面通过活性物质进行了表面改性或活化处理,其生物学实验结果理想,对细胞、组织在支架材料上生长起到有益的作用[1~4]。本实验选择大豆多肽(pol)和羟基磷灰石(HAp)为研究对象,研究其与BC纳米纤维的复合工艺及形成的复合材料的结构和性质。大豆多肽蛋白水解产物,其成分与胶原存在共性,是一种短肽混合物,具有很高的生物活性且成本低,可以被人体直接吸收,是一种理想的生物材料。HAp是自然骨的主要组成部分,具有良好的生物相容性,是极具潜力的人体硬组织修复材料。因此,pol和HAp作为性能优异的生物材料,是常用的组织支架构建材料,能为细胞的黏附、增殖和分化提供更多的活性,改善BC的细胞粘附性,提高其生物活性。实验中,选择葡萄籽提取物原花青素(PA)作为稳定的天然交联剂,将pol与BC复合,然后采用仿生矿化的方法,在BC/pol的纳米纤维表面沉积HAp包覆层,制备BC/pol/HAp复合材料,对其结构、性能进行表征,并分析其生物相容性。

1实验部分

1.1试剂与仪器BC:红茶菌发酵分泌获得,其过程见1.2节中BC的培养;红茶菌:自制,质量分数0.5%的红茶和质量分数10%的葡萄糖,煮成茶糖水,放凉后倒进玻璃瓶纱布封口,置于常温、阴凉处,发酵15d,即得到红茶菌菌种,作为母液备用;去离子水:实验室采用重庆艾科浦AJF系列基础分析型超纯水机自制去离子水;模拟体液(SBF):自制,配制方法依次加入NaCl8g,KCl0.2g,Na2HPO41.44g,KH2PO40.24g,溶于800mL去离子水中,经pH计检测、盐酸稀释液调pH至7.4,定容至1000mL,试剂为分析纯,国药集团化学试剂有限公司;大豆多肽:纯度99.8%,山东康勤生物科技有限公司;原花青素:纯度95%,上海仟爵生物科技有限公司;氢氧化钠、氯化钙、葡萄糖、乙醇:分析纯,国药集团化学试剂有限公司。磁力控温搅拌器:上海麦尚科学仪器有限公司;恒温箱:深圳市易世达仪器设备有限公司;立式高压灭菌锅:济南博鑫生物技术有限公司;超声清洗机:杭州法兰特超声波科技有限公司。

1.2样品制备BC的培养:将去离子水煮沸,加入质量分数0.5%的红茶和质量分数10%的葡萄糖,浸泡20min后滤去茶叶渣,静置冷却。然后加入高温灭菌处理的培养烧杯、锥形瓶中,接种红茶菌,静置培养7d,取液面上层菌膜。BC的清洗纯化:BC膜用蒸馏水多次冲洗,再用质量分数1%的NaOH溶液反复加热清洗,以除去残存的菌体和培养基,用去离子水反复冲洗至中性后,浸泡去离子水中,冷藏,待用。BC/多肽复合材料(BC/pol)制备:将清洗后的BC置于质量分数为0.5%的pol溶液中,温度为37℃,搅拌6h,再将其取出浸于质量分数0.5%的PA溶液中,温度为37℃,搅拌2h。反应结束后,获得PA交联的BC/pol复合材料,将复合材料取出后清洗,待用。BC/多肽/HAp复合材料(BC/pol/HAp)制备:将BC/pol复合材料浸于CaCl2溶液(0.1mol/L),在37℃恒温箱中静置3d后取出浸入SBF中,继续置于37℃恒温箱中,每2d换一次SBF,放置7d后取出,清洗,待用。

1.3测试与表征

1.3.1SEM测试:采用场发射扫描电子显微镜(FE-SEM)观察样品的微观形貌。在测试之前,先将样品用导电胶粘附在样品台上,采用离子溅射仪对样品表面进行喷金(5mA,5min)。1.3.2XRD测试:采用X射线衍射仪(XRD)对试样晶体结构分析(电压40kV,电流强度200mA,扫描范围为1°~60°)。1.3.3FT-IR测试:采用傅里叶变换红外光谱仪(FT-IR)测试样品,分辨率为4cm-1,波数范围为400~4000cm-1。

1.3.4支架材料的生物相容性评价:支架材料的生物相容性评价选用成骨细胞,通过倒置显微镜和噻唑盐微量酶反应比色法(MTT)测试细胞在支架材料上的生长、粘附和增殖情况。1.3.5成骨细胞诱导成骨分化能力的表征:通过碱性磷酸酶(ALP)活性测定,表征成骨细胞诱导成骨分化的能力。

2结果与讨论

Fig.1是BC、BC/pol和BC/pol/HAp3种材料的微观形貌。从图中可以看出,3种试样都保持了三维网络结构,但是随着包覆沉积的pol和HAp颗粒,试样的微观网络结构改变,孔隙的尺寸和含量都降低。从Fig.1(a)中可以看出,纯BC试样保持良好的三维立体网络结构,孔隙直径多变,适合组织、细胞的生长粘附和营养物质的输送,表面包覆pol之后(Fig.1(b)),纳米纤维表面出现pol颗粒,可以为细胞、组织提供粘附位点,提高材料的生物相容性,但是从材料的微观形貌可以看出,其孔隙率和孔隙尺寸都有下降,这一现象在表面沉积HAp后更加明显(Fig.1(c))。将BC/pol仿生矿化处理之后,纤维表面形成均匀的HAp沉积层,包覆每根纤维,HAp作为生物相容性理想的纳米颗粒,与BC复合后,希望能明显改善材料的生物相容性和力学性能。

Fig.2是3种材料在400~4000cm-1范围的FT-IR图谱。从图中可以看出,BC、BC/pol和BC/pol/HAp3种材料均在3360cm-1处有1个较宽的吸收峰,这是纤维素上羟基(-OH)的伸缩振动峰。同时,在3220cm-1也存在1个吸收峰,这是分子间氢键的吸收波数,表明纤维素Iα晶型是实验中BC的主要成分。此外,曲线在2900cm-1和1376cm-1附近的吸收峰分别是对应C-H键的伸缩振动和C-H键的弯曲振动。CH2的对称弯曲振动引起的红外吸收峰则位于1428cm-1处,897cm-1的吸收峰对应于C-H的变形振动。这些特征官能团的存在证明主体材料纤维素的存在[4~6]。对比Fig.2中(a)和(b),2条曲线在1620cm-1和1530cm-1位置发现了明显的特征峰,分别对应酰胺Ⅰ键(C=O)和酰胺Ⅱ键(N-H)的振动吸收峰[4]。这2个特征峰的出现证明了pol的存在,这一结果与FE-SEM结果一致。此外,在Fig.2(c)中还发现了HAp磷氧键(960cm-1)和CO32-(1420cm-1和870cm-1)的特征吸收带[5,7],说明在BC/pol/HAp复合材料上仿生矿化得到的HAp也是缺钙性磷灰石,与人体自然骨的主要成分磷灰石相类似。

Fig.3是BC(a),BC/pol(b)和BC/pol/HAp(c)3种材料的XRD谱图。从图中可以看出,在衍射角14°、16°和22°位置上出现了衍射峰,对应BC的特征晶面((110)、(110)和(020))的衍射峰,证明高结晶度的BC存在[8~10]。其中Fig.3中(b)和(c)2条曲线,在18°位置上出现馒头峰,这是由于结晶度差的高分子物质pol的存在导致的,这与FE-SEM和FT-IR结果相一致,证明了复合材料中成功引入pol。从Fig.3(c)中看出,在2θ=25.9°和2θ=31.7°位置都出现了明显的衍射峰,对比标准谱图发现,这2个衍射峰对应Hap在(002)和(211)晶面的衍射峰[5]。从Fig.3(c)中还可以发现HAp的衍射峰与标准衍射峰对比相对宽化,研究发现仿生矿化得到的HAp结晶度较低,晶粒细小,人体自然骨中的HAp也有这一形貌结构特性。对比BC、pol和HAp的特征衍射峰,在对应位置都有显示,这一结果说明,经过交联复合和仿生矿化,pol和HAp成功引入纳米纤维的表面,2种物质先后在纳米纤维表面形成包覆层,随着包覆层种类和厚度的增加,基体BC的特征吸收峰的相对强度受影响,这也与FE-SEM和FT-IR的测试结果相吻合。

作为一种潜在的组织工程支架材料,其生物相容性、对细胞的粘附程度、生物毒性的大小等是决定其应用前景的关键因素,因此对制备材料生物性能的初步评价也是材料应用的前提,因此,本实验首先采用MTT法对成骨细胞在BC(a),BC/pol(b)和BC/pol/HAp(c)3种材料上的增殖能力进行检测,实验结果Fig.4所示。从实验结果发现,3种材料中,细胞在培养周期均有很好地生长,保持持续的增殖。与普通BC相比,BC/pol(b)和BC/pol/HAp(c)上细胞的增殖速度更快,复合改性改善了材料的生物活性。此外,细胞增殖速率先快后慢,在增殖初期,支架中的养分和空间充足,细胞可以较快地获取新鲜的养分用于生长扩增。随着时间延长,受养分供给和空间减少的影响,细胞的增殖速率减缓,这一现象与细胞的生长过程相关。因此,MTT结果表明,BC,BC/pol和BC/pol/HAp3种材料均可以支持细胞的生长增殖,对细胞的生长和增殖没有副作用,有一定的生物相容性,复合改性提高了材料的生物活性[9],也是由于引进了生物活性更为优异的pol和HAp包覆层所致,引入活性分子既可以为细胞的生长增殖提供营养,也可以为细胞的粘附提供活性点,实现了提高支架生物相容性的预期目的,细胞在3种材料上的增殖能力的强弱顺序为BC/pol/HAp>BC/pol>BC。

Fig.5是在3种支架材料中接种成骨细胞培养3d后材料边缘位置的光学显微镜照片((a)BC,(b)BC/pol和(c)BC/pol/HAp)。从图中可以看出,由于3种试样材料本身不透光,不能直接通过光学显微镜观察细胞在其表面和内部的生长情况,但是在培养液中和支架的边缘处,细胞都有很好的粘附和生长,这一现象证明接种细胞的支架材料本身都是无毒性的,在培养液中浸泡接触没有析出对细胞生长有毒性的成分,这一结果与MTT结果相一致,3种支架材料都有一定的生物相容性,同样表现出在BC/pol和BC/pol/HAp材料中细胞的数量多于纯BC支架的增殖现象。成骨细胞在体内外的生长分化和基因表达一般包括生长增殖期、基质形成及成熟期和基质钙化期。其中基质形成及成熟期伴随着碱性磷酸酶(ALP)活性升高,因此,成骨细胞在支架材料中生命状态可以通过ALP的高低间接表达,ALP可以反映成骨细胞的增殖和分化程度以及对骨基质形成和胶原合成的能力[5]。

Fig.6给出了本实验中接种成骨细胞的3种支架材料中的ALP活性,结果显示,随着培养时间的延长,3种支架材料中细胞的ALP活性都持续增加,尤其是BC/pol/HAp支架中,细胞的ALP活性最高,增长最快,这也与支架中引入了类似自然骨的主要成分HAp有密切关系,HAp的存在进一步增加了成骨细胞的增殖和诱导成骨分化能力,这一实验结果证明了复合改性对改善材料生物活性的效果[10]。

3结论

采用PA交联法和仿生矿化可制备BC/pol和BC/pol/HAp复合材料。FE-SEM、XRD和FT-IR结果表明,pol和HAp颗粒成功引入到BC材料的表面和内部,在纳米纤维的表面形成均匀的包覆层,支架材料的孔隙率和孔隙变小,结构更加紧密,但仍然保持材料三维网络立体结构。通过细胞实验,将成骨细胞接种到3种支架材料中,经过培养后,细胞都有明显的生长增殖,细胞在BC/pol和BC/pol/HAp2种支架上的生长情况优于BC材料,复合改性提高了材料的生物相容性,其中BC/pol/HAp支架材料的生物活性最佳,成骨细胞接种后,大量增殖,并保持了诱导成骨分化的能力,3种支架材料都具有良好的生物活性,在组织工程领域有一定的应用前景。

作者:王静;徐俊青;吴宁;毛丽贺 单位:天津工业大学

细菌纤维素支架的复合改性与生物性能责任编辑:张雨    阅读:人次
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