论文发表 | 论文范文 | 公文范文
新晨范文网
最新公告:目前,本站已经取得了出版物经营许可证 、音像制品许可证,协助杂志社进行初步审稿、征稿工作。咨询:400-675-1600
您现在的位置: 新晨范文网 >> 医学杂志 >> 基础医学杂志 >> 解放军药学学报 >> 正文

红芪多糖HG-2含量及透明质酸测定

定制服务

定制原创材料,由写作老师24小时内创作完成,仅供客户你一人参考学习,无后顾之忧。

发表论文

根据客户的需要,将论文发表在指定类别的期刊,只收50%定金,确定发表通过后再付余款。

加入会员

申请成为本站会员,可以享受经理回访等更17项优惠服务,更可以固定你喜欢的写作老师。

[摘要]目的制备红芪多糖HG-2及建立红芪多糖HG-2的含量测定方法,并联合透明质酸水凝胶测定凝胶时间、释药量、降解及溶胀率等参数。方法采用SephadexG-25纯化制备红芪多糖HG-2,苯酚-硫酸法测定含量,并用化学改性法制备透明质酸(HA)水凝胶,将二者联合制备红芪多糖HG-2HA水凝胶。结果红芪多糖HG-2的含量为95.97%,HA水凝胶的凝胶时间为(180±20)s;溶胀率为42.33%;并在第5天基本降解。红芪多糖HG-2HA水凝胶释药在第120h已趋于平稳,释药量为86.15%。结论选用葡萄糖作为对照品测定红芪多糖HG-2含量的方法简便、准确。红芪多糖HG-2HA水凝胶能够起到缓释作用,二者联用具有可行性,可以为后续动物实验提供理论依据。

关键词]红芪多糖;SephadexG-25;苯酚-硫酸法;透明质酸水凝胶;释药

红芪(HedysariRadix)为豆科岩黄芪属植物多序岩黄芪(HedysarumpolybotrysHand.-Mazz.)的干燥根。具有固表止汗,补气利尿,托毒敛疮等功效[1]。常用于治疗气虚、多汗、慢性肾炎及心脏病等[2]疾病,效果显著。其中红芪多糖作为红芪药材的主要活性成分,具有抗自由基和抗肿瘤、调节免疫等多种药理作用[3-5],由5种单糖组成[6-8]。水凝胶为三维网状结构胶体[9],具有良好的生物相容性[10],常应用于组织工程材料、药物缓释载体、角膜接触镜材料等[11],因其独特的性质,日益为科研研究及临床应用所重视。透明质酸(Hyaluronicacid,HA)属酸性黏多糖,首次发现是从牛眼玻璃体中分离得到[12],并具有改善皮肤代谢、保湿及促进透皮吸收的作用。HA水凝胶是HA与相应交联剂交联制成,其疗效明显延长[13],在治疗骨关节炎、细胞增殖等方面有广泛应用与研究。该课题前期研究发现红芪多糖对骨关节炎有一定的治疗作用,并且相关研究显示HA水凝胶对骨关节炎有一定的治疗作用,且具有缓释药物的作用。因此本试验分离纯化红芪多糖HG-2并将其包封于HA水凝胶中,考察其凝胶时间、溶胀率、释药量以及酶降解速率等参数,并综合以上相关参数分析其可行性,为后续大鼠骨关节炎的治疗作用提供理论依据。

1材料

1.1仪器

UV-3300型紫外可见分光光度计(上海美普达仪器有限公司),KERN-ABJ型电子分析天平(上海实验器材有限公司),YLA-2000型真空干燥箱(龙口市先科仪器公司),3K15型低温高速离心机(SIGMA公司),冷冻干燥机(北京博医康实验仪器有限公司)。

1.2试药

红芪〔购自甘肃省陇西县首阳镇,经甘肃中医药大学杨扶德教授鉴定为豆科岩黄芪属植物多序岩黄芪(HedysarumpolybotrysHand.-Mazz.)的干燥根〕。木糖、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、鼠李糖对照品(均来自上海源叶生物科技有限公司,批号分别为B21880、B21882、B21893、B21891、BB21931)。过硫酸铵(0.1mol•L-1)、四甲基乙二胺(0.1mol•L-1)(西安义信化工有限公司),其余试剂均为分析纯。

2红芪多糖HG-2的制备及含量测定

2.1红芪多糖的提取

称取500.0g干燥红芪药材,浸泡30min后10倍量水煎煮2次(分别为2h,1h),趁热抽滤提取液并浓缩至一定体积,冷却至室温,浓缩液中加入无水乙醇使其含醇量达到60%,放置24h后抽滤,取沉淀用热水溶解,离心滤过,所得滤液再次醇沉至含醇量达80%,室温静置24h。抽滤,沉淀物依次用无水乙醇、丙酮洗涤,待沉淀呈类白色时放入55℃烘箱中烘干即得红芪多糖。

2.2精制红芪多糖

取2.1项下红芪多糖粉末5.0g,溶解并定容至25ml量瓶中,采用水提醇沉使乙醇浓度达到80%,连续沉淀2次,然后抽滤,沉淀物再用无水乙醇、丙酮洗涤至无色,使其在55℃烘箱中烘干,即得精制红芪多糖。

2.3红芪多糖的纯化(脱蛋白)

取红芪多糖10.0g溶解并定容至100ml量瓶中,采用Sevage法,加入同体积的正丁醇-氯仿(1∶4),振荡30min,静置分层,离心除去沉淀,上清液重复操作,直到无明显沉淀,合并上清液后醇沉。沉淀物依次用无水乙醇,丙酮洗涤至无色时,于55℃烘箱中恒温干燥12h,即得脱蛋白红芪多糖。

2.4红芪多糖HG-2的制备

取25.0gSephadexG-25凝胶充分溶胀后装柱。称取脱蛋白红芪多糖2.0g,溶解并定容至50ml量瓶中,微孔滤膜滤过后进样。洗脱剂为蒸馏水,流速:0.8ml•min-1。接样,每3ml为1个样,苯酚-硫酸法跟踪检测,测定吸光度(A)值,并绘制洗脱曲线,见图1。合并主峰流出液,浓缩至一定体积,醇沉至醇浓度为80%,静置24h,抽滤,沉淀物用丙酮脱色,放置55℃恒温干燥箱中12h,即得红芪多糖HG-2。

2.5试验条件的选择

2.5.1最大吸收波长根据紫外分光光谱显示的吸收波长,可得最大吸收波长为490nm。2.5.2对照品取相同浓度的葡萄糖、阿拉伯糖、半乳糖、木糖、鼠李糖和红芪多糖HG-2溶液各2.0ml于具塞试管中,共9组。精密移取5%的苯酚溶液1.0ml至具塞试管中,摇匀,迅速滴加浓硫酸5.0ml,分别将其置于0、60、65、70、75、80、85、90、95℃水浴中恒温15min,然后再冷却至室温,分别在490nm处测定A值,双蒸水空白调零,结果见图2。由图2可知(未将0℃A值计入图2,表1中说明k值变化),不同温度下各糖的A值均有所变化。根据图2曲线,将其按照温度分为0~60、60~65、65~70、70~75、75~80、80~85、85~90、90~95共8个梯度,计算各部分曲线的斜率k值,见表1。从表1中可以得出,在75~80℃梯度内葡萄糖与红芪多糖HG-2其k值最接近,说明二者在此温度范围内变化趋势一致,线性关系较好,且二者75℃下A值均高于80℃的A值,因此在苯酚-硫酸法测定红芪多糖HG-2的含量时,选择葡萄糖为对照品,后续水浴温度均选择75℃。

2.6红芪多糖HG-2的含量测定

2.6.1葡萄糖标准曲线的绘制精密称取葡萄糖对照品2.5mg,蒸馏水定容至25ml量瓶中,使其浓度为0.1mg•ml-1的葡萄糖贮备液。精密移取上述贮备液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4ml于10ml具塞试管中,适量补水至体积为2ml。苯酚-浓硫酸法处理样品,75℃水浴15min,再冷却至室温,以同样处理的双蒸水为空白进行比色,在490nm处分别测定对照品的A值。以A值为纵坐标,以对应的葡萄糖浓度(mg•ml-1)为横坐标绘制标准曲线,得到的标准曲线为:Y=12.254X+0.0077,r=0.9982说明多糖浓度在0~0.1mg•ml-1范围内,与A值呈良好的线性关系。2.6.2换算因子精密称取2.2项下精制HPS10.0mg,蒸馏水溶解并定容至25ml量瓶中。精密吸取该溶液0.2ml于具塞试管中,补水至2.0ml,根据上述条件测定A值,并按照以下公式计算换算因子f。f=W/CD以上计算公式中W为称取的精制HPS的质量(mg);C为多糖溶液中葡萄糖的浓度(mg•ml-1);D为多糖的稀释倍数,计算得f=2.4。2.6.3含量测定精密称取红芪多糖HG-210.0mg,定容至25ml量瓶中。取0.2ml该溶液于10ml具塞试管中,补水至2.0ml,按上述条件测A值并计算。含量(%)=CDf/W×100%,C为HG-2的浓度(mg•ml-1),D为HG-2的稀释倍数,W为称取的HG-2的质量(mg)。计算得红芪多糖HG-2的含量为95.97%。3红芪多糖HG-2HA水凝胶的参数测定

3.1HA水凝胶的制备

精密称取1.0g透明质酸钠(分子量8万~19万),100ml去离子水充分溶解;加1ml甲基丙烯酸酐,用2mol•L-1的氢氧化钠调pH值并保持pH值在8.0~8.5,反应12h。以上操作全部冰浴进行。然后放入冰箱搅拌12h。将上述反应后的溶液装于透析袋并置于水中,3d氯化钠溶液(0.1mol•L-1),3d超纯水,每天换水4次。透析结束后装入50ml离心管,冷冻干燥即得MeHA(甲基丙烯酸酯化的透明质酸)。精密称取2.0mgMeHA置于1.5ml离心管中,加入160μl蒸馏水充分溶解,加入20μl过硫酸铵贮备液,混匀,再加入20μl四甲基乙二胺贮备液,迅速混匀,凝胶后即得HA水凝胶。

3.2红芪多糖HG-2HA水凝胶的制备

称取52.5mg红芪多糖HG-2,定容至50ml量瓶(1.05mg•ml-1)。精密称取2mgMeHA置于1.5ml离心管中,加入160μl红芪多糖HG-2溶液充分溶解,加入20μl过硫酸铵贮备液,混匀,再加入20μl四甲基乙二胺贮备液,迅速混匀,凝胶后即得红芪多糖HG-2HA水凝胶。

3.3红芪多糖HG-2HA水凝胶相关参数的测定

3.3.1凝胶时间(1)按3.2项下制备红芪多糖HG-2HA水凝胶,迅速混匀后置于37℃水浴并开始计时。(2)间歇性的取出离心管翻转,观察液体是否流动。(3)离心管倒立,轻扣管壁,若其中液体不再往下流时,说明凝胶已经形成,记录凝胶时间。结果表明:凝胶时间为(180±20)s。3.3.2溶胀率(1)待水凝胶凝固成胶体后,称质量为M0。(2)将凝胶保持在37℃恒温PBS水浴溶液中,放置过夜,使其自然溶胀。(3)从PBS中取出水凝胶,用滤纸吸去表面溶液,并再次称质量为M1。(4)溶胀率由公式计算得出:溶胀率(%)=(M1-M0)/M0×100%。结果表明:水凝胶溶胀率为42.33%。3.3.3红芪多糖HG-2HA水凝胶的释药制备红芪多糖HG-2水凝胶浸泡在4.0mlPBS中,并置于37℃恒温培养摇床中,振荡速率为50r•min-1。在预先选定的时间点(6、24、48、72、120和144h),取出1ml溶液,使用紫外-可见分光光度计检测其在490nm处的吸收强度,通过标准曲线计算溶液中红芪多糖的浓度,绘制曲线。每次取样后,溶液中都加入1ml新配的PBS,以维持总体积恒定。取3个平行样进行测试,数据表示为平均值。释药曲线见图3。由图3可知,随着时间的增加,红芪多糖HG-2的释放量也在不断增加,第5天红芪多糖HG-2的释药量达到86.15%,说明水凝胶对药物起到了缓释作用。3.3.4水凝胶体外酶降解速率测定(1)通过计算水凝胶在酶作用下质量的变化而得。(2)根据水凝胶的化学成分,配制浓度为6μg•ml-1的透明质酸酶(体液中透明质酸酶的浓度约为60ng•ml-1,扩大100倍)。(3)先让水凝胶在PBS溶液中自然溶胀,然后取出称质量得m0。(4)将水凝胶置于37℃透明质酸酶工作液中,每天换1次溶液。(5)根据需要,控制降解时间,1、3、5d,取出凝胶,称质量得m1(m1,多次称质量直到恒定/变化很小)。(6)降解速率通过公式计算得出:质量损失(%)=(m0-m1)/m0×100%。水凝胶降解速率如图

4.结果表明:

透明质酸水凝胶在第5天已基本降解完全。4讨论本试验采用传统的水提醇沉法得到红芪多糖,并通过脱蛋白、过葡聚糖凝胶柱等方法分离纯化得到红芪多糖HG-2,含量明显提高。在红芪多糖HG-2的制备过程中,样品预处理、柱高、洗脱流速、洗脱剂均为影响因素;如样品用微孔滤膜过滤,凝胶柱一般选择柱高与直径比为20∶1的层析柱,洗脱剂选纯水等。本试验对红芪多糖HG-2的含量测定方法进行研究,选用葡萄糖作对照品,测定其含量的方法简便、可靠。本试验进一步完善了以葡萄糖为对照计算多糖含量,提高了试验的准确性,本试验考察了红芪多糖HG-2与透明质酸水凝胶结合的相关参数,为二者联用提供了理论依据,亦为后续红芪多糖的开发利用奠定基础。

[参考文献]

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[S].北京:中国医药科技出版社,2015:152

[2]魏•吴普等述.清•孙星衍,孙冯翼辑.神农本草经[M].北京:科学技术文献出版社,2003:25

[3]王希玉,路莉,胡燕,等.不同红芪多糖抗肿瘤和免疫调节作用研究[J].中药药理与临床,2009,25(5):72-74

[4]李菲,卫东锋,张俊英,等.红芪多糖对人肺腺癌A549细胞蛋白表达图谱影响的研究[J].中药药理与临床,2014,30(4):54-59

[5]赵良功,李晓东,赵建辉,等.4种红芪多糖对实验性糖尿病小鼠血糖的影响[J].中药材,2009,32(10):1590-1592

[6]马丹,封士兰,赵良功,等.红芪多糖的提取分离纯化及组成分析[J].中国现代应用药学杂志,2008,25(3):177-179

[7]陈同强,AdilbekovJ,赵良功,等.红芪多糖3中4个组分的单糖组成分析及多糖含量测定[J].中国药学杂志,2012,47(7):551-554

[8]惠和平,封士兰,赵良功,等.红芪多糖的纯化及初步结构鉴定[J].时珍国医国药,2010,21(9):2302-2303

[13]赵峰,何薇,刘桂兰,等.透明质酸水凝胶修复大鼠软骨缺损的实验研究[J].重庆医学,2014,43(35):4719-4722

作者:张䶮 周尚儒 燕玉奎 郭玫 单位:甘肃中医药大学药学院

解放军药学学报责任编辑:张雨    阅读:人次
医学杂志相关文章
    没有相关文章

送体验机无需申请